We have merged the two datasets together. Here, we will perform pseudotime analysis on the dataset
Loading required package: viridisLite
Attaching package: ‘Seurat’
The following object is masked from ‘package:SummarizedExperiment’:
Assays
[1] "Seurat is loaded correctly"
Loading required package: cowplot
********************************************************
Note: As of version 1.0.0, cowplot does not change the
default ggplot2 theme anymore. To recover the previous
behavior, execute:
theme_set(theme_cowplot())
********************************************************
Attaching package: ‘cowplot’
The following object is masked from ‘package:patchwork’:
align_plots
[1] "cowplot is loaded correctly"
Loading required package: gridExtra
Attaching package: ‘gridExtra’
The following object is masked from ‘package:Biobase’:
combine
The following object is masked from ‘package:BiocGenerics’:
combine
[1] "gridExtra is loaded correctly"
Loading required package: grid
[1] "grid is loaded correctly"
Loading required package: Hmisc
Loading required package: lattice
Loading required package: survival
Loading required package: Formula
Loading required package: ggplot2
Attaching package: ‘Hmisc’
The following object is masked from ‘package:Seurat’:
Key
The following object is masked from ‘package:Biobase’:
contents
The following objects are masked from ‘package:base’:
format.pval, units
[1] "Hmisc is loaded correctly"
Loading required package: dplyr
Attaching package: ‘dplyr’
The following objects are masked from ‘package:Hmisc’:
src, summarize
The following object is masked from ‘package:gridExtra’:
combine
The following object is masked from ‘package:matrixStats’:
count
The following objects are masked from ‘package:GenomicRanges’:
intersect, setdiff, union
The following object is masked from ‘package:GenomeInfoDb’:
intersect
The following objects are masked from ‘package:IRanges’:
collapse, desc, intersect, setdiff, slice, union
The following objects are masked from ‘package:S4Vectors’:
first, intersect, rename, setdiff, setequal, union
The following object is masked from ‘package:Biobase’:
combine
The following objects are masked from ‘package:BiocGenerics’:
combine, intersect, setdiff, union
The following objects are masked from ‘package:stats’:
filter, lag
The following objects are masked from ‘package:base’:
intersect, setdiff, setequal, union
[1] "dplyr is loaded correctly"
[1] "monocle3 is loaded correctly"
Loading required package: reshape2
[1] "reshape2 is loaded correctly"
tenx.mutant.integrated is needed from the merge script
For monocle input, we can use all WT cells, provided we correct for batch effects.
https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/docs/differential/
We have 5 potential sources of WT information:
10X - 5k run
SS2 - WT cells in this experiment
SS2 - 10X (published)
10X - MCA (published)
10X - 30k run
When you try and use 1 and 2 together, there are issues with calling modules. I think this is to do with the integration that Seurat does, so since the 10X data is complete (i.e. covers the lifecycle), we will sacrifice some extra power (a few more cells) so that we can call more modules.
## load package
library(monocle3)
## extract data from Seurat
seurat.object.all <- tenx.mutant.integrated
# counts
data <- as(as.matrix(GetAssayData(seurat.object.all, assay = "integrated", slot = "data")), 'sparseMatrix')
# meta data
pd <- data.frame(seurat.object.all@meta.data)
## keep only the columns that are relevant
#pData <- pd %>% select(orig.ident, nCount_RNA, nFeature_RNA)
## add gene short name
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
## Construct monocle cds
monocle.object.all <- new_cell_data_set(expression_data = data, cell_metadata = pd, gene_metadata = fData)
## preprocess
monocle.object.all = preprocess_cds(monocle.object.all, num_dim = 100, norm_method = "none")
## plot variance explained plot
plot_pc_variance_explained(monocle.object.all)
## make monocle UMAP
#monocle.object.all = reduce_dimension(monocle.object.all, reduction_method = "UMAP", preprocess_method = "PCA", umap.metric = "euclidean", umap.n_neighbors = 20, umap.min_dist = 0.5, verbose = FALSE)
#plot_cells(monocle.object.all)
## add UMAP from Seurat
monocle.object.all@int_colData@listData$reducedDims@listData[["UMAP"]] <-seurat.object.all@reductions[["DIM_UMAP"]]@cell.embeddings
plot_cells(monocle.object.all)
No trajectory to plot. Has learn_graph() been called yet?
cluster not found in colData(cds), cells will not be colored
cluster_cells() has not been called yet, can't color cells by cluster
## cluster
monocle.object.all = cluster_cells(monocle.object.all)
## plot clusters
plot_cells(monocle.object.all, color_cells_by="partition", group_cells_by="partition", x = 2, y = 1)
No trajectory to plot. Has learn_graph() been called yet?
## reduce partitions to 1
monocle.object.all@clusters$UMAP$partitions[monocle.object.all@clusters$UMAP$partitions == "2"] <- "1"
#map pseudotime
monocle.object.all = learn_graph(monocle.object.all, learn_graph_control=list(ncenter=500), use_partition = FALSE)
|
| | 0%
|
|===========================================================================| 100%
plot_cells(monocle.object.all, color_cells_by="partition", group_cells_by="partition", x = 2, y = 1)
## a helper function to identify the root principal points:
## make cluster 2 the root
get_earliest_principal_node <- function(cds, time_bin="7"){
cell_ids <- which(colData(cds)[, "seurat_clusters"] == time_bin)
closest_vertex <-
cds@principal_graph_aux[["UMAP"]]$pr_graph_cell_proj_closest_vertex
closest_vertex <- as.matrix(closest_vertex[colnames(cds), ])
root_pr_nodes <-
igraph::V(principal_graph(cds)[["UMAP"]])$name[as.numeric(names
(which.max(table(closest_vertex[cell_ids,]))))]
root_pr_nodes
}
## calculate pseudotime
monocle.object.all = order_cells(monocle.object.all, root_pr_nodes=get_earliest_principal_node(monocle.object.all))
monocle.object.all = order_cells(monocle.object.all)
Listening on http://127.0.0.1:6755
## plot
plot_cells(monocle.object.all, color_cells_by = "pseudotime", label_cell_groups=FALSE, cell_size = 1, x = 2, y = 1) +
coord_fixed() +
theme_void() +
labs(title = "Pseudotime") +
theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5))
## help was obtained from here
## https://github.com/satijalab/seurat/issues/1658
## find genes that change as a function of pt
monocle.object.all_pr_test_res <- graph_test(monocle.object.all, neighbor_graph="principal_graph", cores=8)
Registered S3 method overwritten by 'spdep':
method from
plot.mst ape
| | 0%, ETA NA
| | 0%, ETA 01:14:05
| | 0%, ETA 37:37
| | 0%, ETA 26:06
| | 0%, ETA 22:19
| | 0%, ETA 14:55
| | 0%, ETA 13:17
| | 0%, ETA 12:51
| | 0%, ETA 11:26
| | 0%, ETA 11:45
| | 0%, ETA 10:54
| | 0%, ETA 10:20
| | 0%, ETA 09:59
| | 0%, ETA 09:28
| | 0%, ETA 08:23
| | 0%, ETA 08:07
| | 0%, ETA 07:56
| | 0%, ETA 08:05
| | 0%, ETA 07:49
| | 0%, ETA 07:34
| | 0%, ETA 07:16
| | 0%, ETA 07:01
| | 0%, ETA 06:57
| | 0%, ETA 07:00
| | 1%, ETA 06:52
| | 1%, ETA 06:50
| | 1%, ETA 06:40
| | 1%, ETA 06:34
| | 1%, ETA 06:24
| | 1%, ETA 06:25
| | 1%, ETA 06:17
| | 1%, ETA 06:07
| | 1%, ETA 06:13
| | 1%, ETA 06:08
| | 1%, ETA 06:01
| | 1%, ETA 05:54
| | 1%, ETA 05:48
|= | 1%, ETA 05:48
|= | 1%, ETA 05:49
|= | 1%, ETA 05:44
|= | 1%, ETA 05:52
|= | 1%, ETA 05:48
|= | 1%, ETA 05:42
|= | 1%, ETA 05:35
|= | 1%, ETA 05:29
|= | 1%, ETA 05:24
|= | 1%, ETA 05:22
|= | 1%, ETA 05:21
|= | 1%, ETA 05:33
|= | 1%, ETA 05:29
|= | 1%, ETA 05:23
|= | 1%, ETA 05:20
|= | 1%, ETA 05:16
|= | 1%, ETA 05:13
|= | 1%, ETA 05:09
|= | 1%, ETA 05:11
|= | 1%, ETA 05:21
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|= | 1%, ETA 05:13
|= | 1%, ETA 05:11
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|= | 1%, ETA 05:02
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|= | 1%, ETA 05:02
|= | 1%, ETA 05:04
|= | 1%, ETA 04:59
|= | 1%, ETA 04:57
|= | 1%, ETA 04:55
|= | 1%, ETA 04:53
|= | 1%, ETA 05:03
|= | 2%, ETA 05:01
|= | 2%, ETA 04:58
|= | 2%, ETA 04:57
|= | 2%, ETA 04:54
|= | 2%, ETA 04:51
|= | 2%, ETA 04:48
|= | 2%, ETA 04:46
|= | 2%, ETA 04:53
|= | 2%, ETA 04:56
|= | 2%, ETA 04:54
|= | 2%, ETA 04:54
|= | 2%, ETA 04:52
|= | 2%, ETA 04:48
|= | 2%, ETA 04:46
|= | 2%, ETA 04:49
|= | 2%, ETA 04:49
|= | 2%, ETA 04:53
|= | 2%, ETA 04:51
|= | 2%, ETA 04:50
|= | 2%, ETA 04:47
|= | 2%, ETA 04:45
|= | 2%, ETA 04:44
|= | 2%, ETA 04:45
|= | 2%, ETA 04:43
|= | 2%, ETA 04:51
|= | 2%, ETA 04:48
|= | 2%, ETA 04:46
|= | 2%, ETA 04:44
|= | 2%, ETA 04:42
|= | 2%, ETA 04:41
|= | 2%, ETA 04:41
|= | 2%, ETA 04:38
|= | 2%, ETA 04:44
|= | 2%, ETA 04:41
|= | 2%, ETA 04:39
|= | 2%, ETA 04:36
|= | 2%, ETA 04:39
|= | 2%, ETA 04:37
|= | 2%, ETA 04:35
|= | 2%, ETA 04:33
|= | 2%, ETA 04:40
|= | 2%, ETA 04:38
|== | 2%, ETA 04:36
|== | 2%, ETA 04:35
|== | 2%, ETA 04:36
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|== | 2%, ETA 04:31
|== | 2%, ETA 04:36
|== | 2%, ETA 04:34
|== | 3%, ETA 04:33
|== | 3%, ETA 04:33
|== | 3%, ETA 04:31
|== | 3%, ETA 04:31
|== | 3%, ETA 04:30
|== | 3%, ETA 04:30
|== | 3%, ETA 04:33
|== | 3%, ETA 04:31
|== | 3%, ETA 04:29
|== | 3%, ETA 04:29
|== | 3%, ETA 04:29
|== | 3%, ETA 04:28
|== | 3%, ETA 04:30
|== | 3%, ETA 04:31
|== | 3%, ETA 04:32
|== | 3%, ETA 04:33
|== | 3%, ETA 04:32
|== | 3%, ETA 04:31
|== | 3%, ETA 04:29
|== | 3%, ETA 04:29
|== | 3%, ETA 04:31
|== | 3%, ETA 04:32
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|== | 3%, ETA 04:30
|== | 3%, ETA 04:30
|== | 3%, ETA 04:30
|== | 3%, ETA 04:29
|== | 3%, ETA 04:28
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|== | 3%, ETA 04:31
|== | 3%, ETA 04:30
|== | 3%, ETA 04:29
|== | 3%, ETA 04:30
|== | 3%, ETA 04:28
|== | 3%, ETA 04:28
|== | 3%, ETA 04:27
|== | 3%, ETA 04:28
|== | 3%, ETA 04:28
|== | 3%, ETA 04:28
|== | 3%, ETA 04:27
|== | 3%, ETA 04:26
|== | 3%, ETA 04:26
|== | 3%, ETA 04:24
|== | 3%, ETA 04:24
|== | 3%, ETA 04:27
|== | 3%, ETA 04:27
|== | 3%, ETA 04:27
|== | 3%, ETA 04:26
|== | 3%, ETA 04:24
|== | 3%, ETA 04:23
|== | 4%, ETA 04:23
|== | 4%, ETA 04:22
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|== | 4%, ETA 04:25
|== | 4%, ETA 04:25
|== | 4%, ETA 04:23
|== | 4%, ETA 04:23
|== | 4%, ETA 04:22
|== | 4%, ETA 04:21
|== | 4%, ETA 04:22
|== | 4%, ETA 04:25
|== | 4%, ETA 04:25
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|== | 4%, ETA 04:23
|== | 4%, ETA 04:23
|== | 4%, ETA 04:22
|== | 4%, ETA 04:22
|== | 4%, ETA 04:23
|== | 4%, ETA 04:22
|== | 4%, ETA 04:21
|=== | 4%, ETA 04:20
|=== | 4%, ETA 04:21
|=== | 4%, ETA 04:21
|=== | 4%, ETA 04:20
|=== | 4%, ETA 04:21
|=== | 4%, ETA 04:20
|=== | 4%, ETA 04:19
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:19
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:19
|=== | 4%, ETA 04:20
|=== | 4%, ETA 04:19
|=== | 4%, ETA 04:19
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:17
|=== | 4%, ETA 04:19
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:17
|=== | 4%, ETA 04:18
|=== | 4%, ETA 04:18
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|=== | 4%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:20
|=== | 5%, ETA 04:19
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:19
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:17
|=== | 5%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:15
|=== | 5%, ETA 04:15
|=== | 5%, ETA 04:15
|=== | 5%, ETA 04:14
|=== | 5%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:16
|=== | 5%, ETA 04:14
|=== | 5%, ETA 04:14
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:14
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:14
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:12
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:12
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:12
|=== | 5%, ETA 04:12
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:12
|=== | 5%, ETA 04:11
|=== | 5%, ETA 04:13
|=== | 5%, ETA 04:13
|==== | 5%, ETA 04:13
|==== | 6%, ETA 04:12
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:12
|==== | 6%, ETA 04:12
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|==== | 6%, ETA 04:12
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:10
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:12
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:10
|==== | 6%, ETA 04:09
|==== | 6%, ETA 04:10
|==== | 6%, ETA 04:09
|==== | 6%, ETA 04:10
|==== | 6%, ETA 04:11
|==== | 6%, ETA 04:10
|==== | 6%, ETA 04:10
|==== | 6%, ETA 04:09
|==== | 6%, ETA 04:09
|==== | 6%, ETA 04:08
|==== | 6%, ETA 04:09
|==== | 6%, ETA 04:09
|==== | 6%, ETA 04:10
|==== | 6%, ETA 04:09
|==== | 6%, ETA 04:09
|==== | 6%, ETA 04:08
|==== | 6%, ETA 04:08
|==== | 6%, ETA 04:07
|==== | 6%, ETA 04:07
|==== | 6%, ETA 04:08
|==== | 6%, ETA 04:08
|==== | 6%, ETA 04:08
|==== | 6%, ETA 04:08
|==== | 6%, ETA 04:07
|==== | 6%, ETA 04:07
|==== | 6%, ETA 04:07
|==== | 6%, ETA 04:07
|==== | 6%, ETA 04:06
|==== | 6%, ETA 04:07
|==== | 6%, ETA 04:06
|==== | 6%, ETA 04:07
|==== | 6%, ETA 04:07
|==== | 6%, ETA 04:06
|==== | 6%, ETA 04:06
|==== | 7%, ETA 04:06
|==== | 7%, ETA 04:06
|==== | 7%, ETA 04:06
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:06
|==== | 7%, ETA 04:06
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:06
|==== | 7%, ETA 04:06
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:04
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:04
|==== | 7%, ETA 04:04
|==== | 7%, ETA 04:05
|==== | 7%, ETA 04:04
|==== | 7%, ETA 04:04
|==== | 7%, ETA 04:03
|==== | 7%, ETA 04:04
|==== | 7%, ETA 04:04
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:04
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:04
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:02
|===== | 7%, ETA 04:04
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:02
|===== | 7%, ETA 04:04
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:02
|===== | 7%, ETA 04:04
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:02
|===== | 7%, ETA 04:03
|===== | 7%, ETA 04:02
|===== | 8%, ETA 04:02
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:03
|===== | 8%, ETA 04:02
|===== | 8%, ETA 04:02
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:02
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 04:01
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 03:59
|===== | 8%, ETA 03:59
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 04:00
|===== | 8%, ETA 03:59
|===== | 8%, ETA 03:59
|===== | 8%, ETA 03:59
|===== | 8%, ETA 03:58
|===== | 8%, ETA 03:58
|===== | 8%, ETA 03:59
|===== | 8%, ETA 03:59
|===== | 8%, ETA 03:59
|===== | 8%, ETA 03:58
|===== | 8%, ETA 03:58
|===== | 8%, ETA 03:58
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|============================================================| 100%, Elapsed 03:50
## find significant genes
pr_deg_ids <- row.names(subset(monocle.object.all_pr_test_res, q_value < 0.05))
## collect into modules
gene_module_df_all <- find_gene_modules(monocle.object.all[pr_deg_ids,], resolution=c(1,10^seq(-6,-1)))
Found more than one class "dist" in cache; using the first, from namespace 'spam'
Also defined by ‘BiocGenerics’
Found more than one class "dist" in cache; using the first, from namespace 'spam'
Also defined by ‘BiocGenerics’
## how many genes in modules?
dim(gene_module_df_all)
[1] 105 5
## create a dataframe with clusters and modules
cell_group_df_all <- tibble::tibble(cell=row.names(colData(monocle.object.all)), cell_group=colData(monocle.object.all)$seurat_clusters)
## aggregate gene expression
agg_mat_all <- aggregate_gene_expression(monocle.object.all, gene_module_df_all, cell_group_df_all)
NaNs produced
## modify row names
row.names(agg_mat_all) <- stringr::str_c("Module ", row.names(agg_mat_all))
## plot heatmap
pheatmap::pheatmap(agg_mat_all, scale="column", clustering_method="ward.D2")
## access the closest principal graph node vertex for each cell and assign it as a column in your colData table using:
colData(monocle.object.all)$closest_vertex <- monocle.object.all@principal_graph_aux[["UMAP"]]$pr_graph_cell_proj_closest_vertex[,1]
plot_cells(monocle.object.all, color_cells_by = "closest_vertex", label_cell_groups = FALSE)
## then subset the usual way:
#monocle.object_male <- monocle.object[,colData(monocle.object)$closest_vertex %in% c(1, 2, 3)]
## load package to plot ridge plots
library(ggridges)
## extract pseudotime values:
pt_values <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object.all, reduction_method = "UMAP"))
pt_values$cell_name <- rownames(pt_values)
meta_data_df <- as.data.frame(monocle.object.all@colData)
meta_data_df$cell_name <- rownames(meta_data_df)
meta_data_df <- merge(meta_data_df, pt_values, by = "cell_name")
names(meta_data_df)[128] <- "pt"
## define which clusters will be which identity
male_clusters <- c("45", "30", "42", "18", "25", "37", "32", "29")
female_clusters <- c("39", "40", "38", "10", "26", "19", "17", "36")
asex_clusters <- c("0", "22", "8", "1", "20", "2", "15", "6", "14", "12", "13", "23", "31", "21", "44", "33", "35", "28", "27", "34", "43", "41", "4", "16", "5", "11", "7", "11", "3", "9", "24")
## make a dataframe for just male cells:
male_cells_df <- meta_data_df[which(meta_data_df$seurat_clusters %in% male_clusters),]
female_cells_df <- meta_data_df[which(meta_data_df$seurat_clusters %in% female_clusters),]
ggplot(male_cells_df, aes(x = pt, y = reorder(identity_combined, pt, median), fill = stat(x))) +
geom_density_ridges_gradient(scale = 3, rel_min_height = 0.01, jittered_points = TRUE, quantile_lines = TRUE, quantiles = 2, point_alpha = 0.5, alpha = 0.5) +
scale_fill_viridis_c(name = "Pseudotime", option = "C") +
labs(title = 'Male PT by genotype') +
theme_classic()
ggplot(female_cells_df, aes(x = pt, y = reorder(identity_combined, pt, median), fill = stat(x))) +
geom_density_ridges_gradient(scale = 3, rel_min_height = 0.01, jittered_points = TRUE, quantile_lines = TRUE, quantiles = 2) +
scale_fill_viridis_c(name = "Pseudotime", option = "C") +
labs(title = 'Female PT by genotype') +
theme_classic()
The above analysis results in hardly any genes in the modules, most likely due to the normalisation effect of Seurat. Here, we will take just the 10X object, which has coverage of the lifecyle and also does not require batch correction.
## load package
#library(monocle3)
## help was obtained from here
## https://github.com/satijalab/seurat/issues/1658
## extract data
## this extracts wt only cells
#wt_cells <- rownames(tenx.mutant.integrated@meta.data[which(tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_combined == "WT" | tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_combined == "WT_10X"),])
## extracts only 10x cells
wt_cells <- rownames(tenx.mutant.integrated@meta.data[which(tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_combined == "WT_10X"),])
## make a new Seurat of this
seurat.object <-subset(tenx.mutant.integrated, cells = wt_cells)
## check that this is the same as the pb_sex_filtered object
#data_test <- as(as.matrix(GetAssayData(pb_sex_filtered, assay = "RNA", slot = "data")), 'sparseMatrix')
#is.equal
#is.identical
## make new counts and pheno:
## the reason we use the integrated and then subsetted is because these cells have been normalised whereas the cells in pb_sex_filtered have not been normalised (well they have but with doublets in them)
data <- as(as.matrix(GetAssayData(seurat.object, assay = "RNA", slot = "data")), 'sparseMatrix')
pd <- data.frame(seurat.object@meta.data)
## keep only the columns that are relevant
#pData <- pd %>% select(orig.ident, nCount_RNA, nFeature_RNA)
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
## Construct monocle cds
monocle.object <- new_cell_data_set(expression_data = data, cell_metadata = pd, gene_metadata = fData)
## preprocess
monocle.object = preprocess_cds(monocle.object, num_dim = 50, norm_method = "none")
### if using integrated data:
# norm_method = "none", alignment_group = "~ experiment"
plot_pc_variance_explained(monocle.object)
monocle.object = reduce_dimension(monocle.object, reduction_method = "UMAP", preprocess_method = "PCA", umap.metric = "euclidean", umap.n_neighbors = 50, umap.min_dist = 0.5, verbose = FALSE)
Found more than one class "dist" in cache; using the first, from namespace 'spam'
Also defined by ‘BiocGenerics’
Found more than one class "dist" in cache; using the first, from namespace 'spam'
Also defined by ‘BiocGenerics’
plot_cells(monocle.object, color_cells_by="experiment")
No trajectory to plot. Has learn_graph() been called yet?
monocle.object = learn_graph(monocle.object, learn_graph_control=list(ncenter=300), use_partition = FALSE)
|
| | 0%
|
|===========================================================================| 100%
# learn_graph_control=list(ncenter=500) - play with this parameter
## Plot cells
plot_cells(monocle.object, color_cells_by="partition", group_cells_by="partition", x = 2, y = 1)
## a helper function to identify the root principal points:
get_earliest_principal_node <- function(cds, time_bin="4"){
cell_ids <- which(colData(cds)[, "seurat_clusters"] == time_bin)
closest_vertex <-
cds@principal_graph_aux[["UMAP"]]$pr_graph_cell_proj_closest_vertex
closest_vertex <- as.matrix(closest_vertex[colnames(cds), ])
root_pr_nodes <-
igraph::V(principal_graph(cds)[["UMAP"]])$name[as.numeric(names
(which.max(table(closest_vertex[cell_ids,]))))]
root_pr_nodes
}
## Order the cells and caclulate pseudotime
#monocle.object = order_cells(monocle.object, root_pr_nodes=get_earliest_principal_node(monocle.object))
monocle.object = order_cells(monocle.object)
Listening on http://127.0.0.1:6755
## Plot
plot_cells(monocle.object, color_cells_by = "pseudotime", label_cell_groups=FALSE, cell_size = 2, x = 2, y = 1) +
coord_fixed() +
theme_void() +
labs(title = "Pseudotime") +
theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5))
## find significant genes
pr_deg_ids <- row.names(subset(monocle.object_pr_test_res, q_value < 0.05))
## collect into modules
gene_module_df <- find_gene_modules(monocle.object[pr_deg_ids,], resolution=c(10^seq(-6,2)))
Found more than one class "dist" in cache; using the first, from namespace 'spam'
Also defined by ‘BiocGenerics’
Found more than one class "dist" in cache; using the first, from namespace 'spam'
Also defined by ‘BiocGenerics’
## how many genes in modules?
dim(gene_module_df)
[1] 4578 5
[1] "there are 23 modules"
Make a dataframe to plot
## make cell group df
cell_group_df <- tibble::tibble(cell=row.names(colData(monocle.object)), cell_group=colData(monocle.object)$seurat_clusters)
## make plotting df
agg_mat <- aggregate_gene_expression(monocle.object, gene_module_df, cell_group_df)
Find out how many genes there are per total so we can add this to the plot
## how many genes per module?
genes_per_module <- as.data.frame(table(gene_module_df$module))
genes_per_module
Make annotations to add to the heatmap
## change names for row names to include "module " at the beginning of them
row.names(agg_mat) <- stringr::str_c("Module ", row.names(agg_mat))
## add number of cells to the rownames for the module
for(i in seq_along(genes_per_module$Freq)){
row.names(agg_mat)[i] <- stringr::str_c(row.names(agg_mat)[i]," (n = " ,genes_per_module$Freq[i], ")")
}
## create annotation of clusters for heatmap
cluster_anno <- data.frame(cluster = unique(colData(monocle.object)$seurat_clusters))
row.names(cluster_anno) <- cluster_anno$cluster
## clusters were defined in the merge script earlier as:
male_clusters <- c("26", "22", "11", "17")
female_clusters <- c("30", "32", "27", "12", "13", "18")
asex_clusters <- c("7", "10", "9", "14", "1", "3", "4", "8", "5", "6", "2", "0", "16", "19", "28", "15", "21", "23", "24", "25", "31", "29", "33")
bipotential_clusters <- c("20")
## add identities to the column
cluster_anno$group <- NA
cluster_anno$group[which(cluster_anno$cluster %in% asex_clusters)] <- "Asexual"
cluster_anno$group[which(cluster_anno$cluster %in% male_clusters)] <- "Male"
cluster_anno$group[which(cluster_anno$cluster %in% female_clusters)] <- "Female"
cluster_anno$group[which(cluster_anno$cluster %in% bipotential_clusters)] <- "Committed"
cluster_anno <- cluster_anno[ , 2, drop = FALSE]
cluster_anno
## Make a df of meta data
## this is used later in the ridgeplots too
## extract pseudotime values
pt_values <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object, reduction_method = "UMAP"))
pt_values$cell_name <- rownames(pt_values)
meta_data_df <- as.data.frame(monocle.object@colData)
meta_data_df$cell_name <- rownames(meta_data_df)
meta_data_df <- merge(meta_data_df, pt_values, by = "cell_name")
Plot
pheatmap::pheatmap(agg_mat_df,
scale="column",
cluster_cols = FALSE,
clustering_method="ward.D2",
annotation_col = cluster_anno,
annotation_colors = annotation_colours,
#gaps_col = c(28,29,37),
cutree_rows = 12) +
theme(legend.position = "bottom")
NULL
ComplexHeatmap version
library(ComplexHeatmap)
========================================
ComplexHeatmap version 2.4.2
Bioconductor page: http://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap/
Github page: https://github.com/jokergoo/ComplexHeatmap
Documentation: http://jokergoo.github.io/ComplexHeatmap-reference
If you use it in published research, please cite:
Gu, Z. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional
genomic data. Bioinformatics 2016.
This message can be suppressed by:
suppressPackageStartupMessages(library(ComplexHeatmap))
========================================
library(RColorBrewer)
## pheatmap calculates Z scores for plotting values
scale_matrix_by_cols <- function (x)
{
m = apply(x, 1, mean, na.rm = T)
s = apply(x, 1, sd, na.rm = T)
return((x - m)/s)
}
## calculate z score by col
agg_mat_df_scaled <- t(as.matrix(scale_matrix_by_cols(t(agg_mat_df))))
## add annotation:
heatmap_annotation <- HeatmapAnnotation(df = cluster_anno,
col = list(
Identity = c(Male="#016c00", Female="#a52b1e", Asexual= "#0052c5", Committed = "#f2eb23")),
annotation_legend_param = list(Median_Pseudotime_of_Cluster = list(direction = "horizontal"), Identity = list(nrow = 1)))
## plot
modules_heatmap <- Heatmap(agg_mat_df_scaled,
column_order = NULL,
clustering_method_rows = "ward.D2",
bottom_annotation = heatmap_annotation,
col = colorRampPalette(rev(brewer.pal(n = 7, name =
"RdYlBu")))(100),
heatmap_legend_param = list(direction = "horizontal"))
draw(modules_heatmap, merge_legend = TRUE, heatmap_legend_side = "bottom",
annotation_legend_side = "bottom")
## https://www.biostars.org/p/380544/
## subset aggregated matrix to take out problematic clusters 22, 42, (44 - alreayd removed as it doesn't have any 10x cells)
agg_mat_df_scaled_subset <- agg_mat_df_scaled[, -which(colnames(agg_mat_df_scaled) %in% c(22,42))]
## make df of data
agg_mat_df_scaled_subset_df <- as.data.frame(agg_mat_df_scaled_subset)
## remove levels in my_levels that are not present here - i.e. clusters that are missing because they are not represented in the 10X data
my_levels_10x_data_subset <- my_levels[which(my_levels %in% colnames(agg_mat_df_scaled_subset_df))]
## sort the values
agg_mat_df_scaled_subset <- agg_mat_df_scaled_subset[ ,(match(my_levels_10x_data_subset, colnames(agg_mat_df_scaled_subset)))]
## subset anno
cluster_anno_subset <- cluster_anno[-which(rownames(cluster_anno) %in% c(22,42)),]
## subset the annotation
## add annotation:
heatmap_annotation_subset <- HeatmapAnnotation(df = cluster_anno_subset,
col = list(
Identity = c(Male="#016c00", Female="#a52b1e", Asexual= "#0052c5", Committed = "#f2eb23")),
annotation_legend_param = list(Median_Pseudotime_of_Cluster = list(direction = "horizontal"), Identity = list(nrow = 1)))
library(ComplexHeatmap)
library(RColorBrewer)
modules_heatmap <- Heatmap(agg_mat_df_scaled_subset,
column_order = NULL,
clustering_method_rows = "ward.D2",
bottom_annotation = heatmap_annotation_subset,
col = colorRampPalette(rev(brewer.pal(n = 7, name =
"RdYlBu")))(100),
heatmap_legend_param = list(direction = "horizontal"))
draw(modules_heatmap, merge_legend = TRUE, heatmap_legend_side = "bottom",
annotation_legend_side = "bottom")
## save the gene modules in case you want to return to these later
modules_df_original_10x_data_set <- gene_module_df
Find out which modules our mutant genes reside in
## create a list of our mutant gene IDs
list_of_mutant_genes <- c("PBANKA-0828000", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1447900", "PBANKA-0102400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1418100", "PBANKA-1144800", "PBANKA-0902300", "PBANKA-0413400", "PBANKA-1454800")
## make a dataframe to convert the gene IDs into actual IDs
df_mutant_ids <- as.data.frame(unique(cbind(tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_gene_updated, tenx.mutant.integrated@meta.data$identity_updated)))[-c(1, 4),]
# remove the "820" bit on 10
df_mutant_ids$V1 <- gsub("_820", "", df_mutant_ids$V1)
# change the underscore (_) to a dash (-) in gene IDs
df_mutant_ids$V1 <- gsub("_", "-", df_mutant_ids$V1)
names(df_mutant_ids) <- c("gene_ID", "mutant_identity")
## subset modules df to include only mutant gene IDs
df_mutant_gene_modules <- as.data.frame(gene_module_df[which(gene_module_df$id %in% list_of_mutant_genes),])
names(df_mutant_gene_modules)[1] <- "gene_ID"
## merge dataframes
df_mutant_gene_modules <- merge(df_mutant_gene_modules, df_mutant_ids, by = "gene_ID")
## Inspect
df_mutant_gene_modules
so modules of interest are:
table(df_mutant_gene_modules$module)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 0 0 0 0 0 0 0 5 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0
Which modules do other genes of interest lie in?:
## landmark genes (genes of interest)
# AP2G - PBANKA-1437500
# AP2 - PBANKA-0909600 - from poran paper
# AP2G-2 - PBANKA-1034300
## create a list of landmark genes
list_of_landmark_genes <- c("PBANKA-1437500", "PBANKA-0909600","PBANKA-1034300")
## make dataframe
df_landmark_gene_modules <- gene_module_df[which(gene_module_df$id %in% list_of_landmark_genes),]
## inspect
df_landmark_gene_modules
It would be nice to include a measure of Psuedotime in the heatmap. We will first test the variance of Pseudotime in each cluster
## redefine order of clusters:
meta_data_df$seurat_clusters <- factor(x = meta_data_df$seurat_clusters, levels = my_levels)
## plot
ggplot(meta_data_df, aes(x = pt, y = seurat_clusters, fill = stat(x))) +
geom_density_ridges_gradient(scale = 3, rel_min_height = 0.01, jittered_points = TRUE, quantile_lines = TRUE, quantiles = 2, point_alpha = 0.5, alpha = 0.5) +
scale_fill_viridis_c(name = "Pseudotime", option = "C") +
labs(title = 'PT by Cluster') +
theme_classic() +
## annotate males
geom_hline(aes(yintercept = 37.5)) +
## annotate females
geom_hline(aes(yintercept = 29.5)) +
## annotate hermaphrodite
geom_hline(aes(yintercept = 28.5))
Make a heatmap of module expression in mutants:
## the aggregate_gene_expression function in Monocle is located here: https://github.com/cole-trapnell-lab/monocle3/blob/1a02274209c765fe7a60f533a31b1da3dacf6785/R/cluster_genes.R
## One can use the function as is if you make a monocle object of all cells and use the module df created above
## separate the mutants into each sex
## define which clusters will be which identity
male_clusters <- c("45", "30", "42", "18", "25", "37", "32", "29")
female_clusters <- c("39", "40", "38", "10", "26", "19", "17", "36")
asex_clusters <- c("0", "22", "8", "1", "20", "2", "15", "6", "14", "12", "13", "23", "31", "21", "44", "33", "35", "28", "27", "34", "43", "41", "4", "16", "5", "11", "7", "11", "3", "9", "24")
## make a dataframe for just male cells:
male_cells_df <- meta_data_df[which(meta_data_df$seurat_clusters %in% male_clusters),]
female_cells_df <- meta_data_df[which(meta_data_df$seurat_clusters %in% female_clusters),]
## make cell group df
cell_group_df_genotype <- tibble::tibble(cell=row.names(colData(monocle.object)), cell_group=colData(monocle.object)$identity_combined)
## make plotting df
agg_mat_mutants <- aggregate_gene_expression(monocle.object, gene_module_df, cell_group_df_genotype)
## plot
pheatmap::pheatmap(agg_mat_mutants, scale="column", clustering_method="ward.D2")
## extract pt values
pt_values <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object.all, reduction_method = "UMAP"))
tenx.mutant.integrated <- AddMetaData(tenx.mutant.integrated, pt_values, "old_pt_values")
Save old modules
write.csv(modules_df_original_10x_data_set, file = "~/data_to_export/modules_df_original_10x_data_set.csv")
Save environment
## This saves everything in the global environment for easy recall later
#save.image(file = "GCSKO_pseudotime_allcells.RData")
#load(file = "GCSKO_pseudotime_allcells.RData")
Save object(s)
## save integrated object to file
#saveRDS(tenx.mutant.integrated, file = "/Users/Andy/GCSKO/GCSKO_analysis_git/data_to_export/tenx.mutant.integrated.RDS")
## restore the object
#tenx.mutant.integrated <- readRDS("/Users/Andy/GCSKO/GCSKO_analysis_git/data_to_export/tenx.mutant.integrated.RDS")
R version 4.0.2 (2020-06-22)
Platform: x86_64-apple-darwin17.0 (64-bit)
Running under: macOS Catalina 10.15.6
Matrix products: default
BLAS: /System/Library/Frameworks/Accelerate.framework/Versions/A/Frameworks/vecLib.framework/Versions/A/libBLAS.dylib
LAPACK: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/4.0/Resources/lib/libRlapack.dylib
locale:
[1] en_GB.UTF-8/en_GB.UTF-8/en_GB.UTF-8/C/en_GB.UTF-8/en_GB.UTF-8
attached base packages:
[1] grid stats4 parallel stats graphics grDevices utils datasets
[9] methods base
other attached packages:
[1] RColorBrewer_1.1-2 ComplexHeatmap_2.4.2
[3] shiny_1.5.0 reshape2_1.4.4
[5] dplyr_1.0.0 Hmisc_4.4-0
[7] ggplot2_3.3.2 Formula_1.2-3
[9] survival_3.2-3 lattice_0.20-41
[11] gridExtra_2.3 cowplot_1.0.0
[13] Seurat_3.2.0 viridis_0.5.1
[15] viridisLite_0.3.0 patchwork_1.0.1
[17] monocle3_0.2.2 SingleCellExperiment_1.10.1
[19] SummarizedExperiment_1.18.2 DelayedArray_0.14.1
[21] matrixStats_0.56.0 GenomicRanges_1.40.0
[23] GenomeInfoDb_1.24.2 IRanges_2.22.2
[25] S4Vectors_0.26.1 Biobase_2.48.0
[27] BiocGenerics_0.34.0
loaded via a namespace (and not attached):
[1] reticulate_1.16 tidyselect_1.1.0 htmlwidgets_1.5.1
[4] Rtsne_0.15 devtools_2.3.0 munsell_0.5.0
[7] units_0.6-7 codetools_0.2-16 ica_1.0-2
[10] future_1.18.0 miniUI_0.1.1.1 withr_2.2.0
[13] colorspace_1.4-1 knitr_1.29 rstudioapi_0.11
[16] ROCR_1.0-11 tensor_1.5 pbmcapply_1.5.0
[19] listenv_0.8.0 labeling_0.3 slam_0.1-47
[22] GenomeInfoDbData_1.2.3 polyclip_1.10-0 farver_2.0.3
[25] pheatmap_1.0.12 rprojroot_1.3-2 Matrix.utils_0.9.8
[28] LearnBayes_2.15.1 coda_0.19-3 vctrs_0.3.2
[31] generics_0.0.2 xfun_0.15 R6_2.4.1
[34] clue_0.3-57 rsvd_1.0.3 fields_10.3
[37] bitops_1.0-6 spatstat.utils_1.17-0 assertthat_0.2.1
[40] promises_1.1.1 scales_1.1.1 nnet_7.3-14
[43] gtable_0.3.0 globals_0.12.5 processx_3.4.3
[46] goftest_1.2-2 spam_2.5-1 rlang_0.4.7
[49] GlobalOptions_0.1.2 splines_4.0.2 lazyeval_0.2.2
[52] acepack_1.4.1 checkmate_2.0.0 yaml_2.2.1
[55] abind_1.4-5 backports_1.1.8 httpuv_1.5.4
[58] tools_4.0.2 usethis_1.6.1 spData_0.3.8
[61] ellipsis_0.3.1 raster_3.3-13 proxy_0.4-24
[64] sessioninfo_1.1.1 ggridges_0.5.2 Rcpp_1.0.5
[67] plyr_1.8.6 base64enc_0.1-3 zlibbioc_1.34.0
[70] classInt_0.4-3 purrr_0.3.4 RCurl_1.98-1.2
[73] ps_1.3.3 prettyunits_1.1.1 rpart_4.1-15
[76] deldir_0.1-28 GetoptLong_1.0.2 pbapply_1.4-2
[79] zoo_1.8-8 grr_0.9.5 ggrepel_0.8.2
[82] cluster_2.1.0 fs_1.4.2 tinytex_0.25
[85] magrittr_1.5 RSpectra_0.16-0 data.table_1.12.8
[88] circlize_0.4.10 gmodels_2.18.1 lmtest_0.9-37
[91] RANN_2.6.1 fitdistrplus_1.1-1 pkgload_1.1.0
[94] mime_0.9 evaluate_0.14 xtable_1.8-4
[97] jpeg_0.1-8.1 shape_1.4.4 testthat_2.3.2
[100] compiler_4.0.2 tibble_3.0.3 maps_3.3.0
[103] KernSmooth_2.23-17 crayon_1.3.4 htmltools_0.5.0
[106] mgcv_1.8-31 later_1.1.0.1 spdep_1.1-5
[109] tidyr_1.1.0 expm_0.999-5 DBI_1.1.0
[112] MASS_7.3-51.6 boot_1.3-25 sf_0.9-5
[115] leidenbase_0.1.1 Matrix_1.2-18 cli_2.0.2
[118] gdata_2.18.0 dotCall64_1.0-0 igraph_1.2.5
[121] pkgconfig_2.0.3 foreign_0.8-80 sp_1.4-2
[124] plotly_4.9.2.1 XVector_0.28.0 stringr_1.4.0
[127] callr_3.4.3 digest_0.6.25 sctransform_0.2.1
[130] RcppAnnoy_0.0.16 spatstat.data_1.4-3 rmarkdown_2.3
[133] leiden_0.3.3 htmlTable_2.0.1 uwot_0.1.8
[136] DelayedMatrixStats_1.10.1 gtools_3.8.2 rjson_0.2.20
[139] lifecycle_0.2.0 nlme_3.1-148 jsonlite_1.7.0
[142] desc_1.2.0 fansi_0.4.1 pillar_1.4.6
[145] fastmap_1.0.1 httr_1.4.2 pkgbuild_1.1.0
[148] glue_1.4.1 remotes_2.1.1 spatstat_1.64-1
[151] png_0.1-7 class_7.3-17 stringi_1.4.6
[154] latticeExtra_0.6-29 memoise_1.1.0 e1071_1.7-3
[157] irlba_2.3.3 future.apply_1.6.0 ape_5.4